Por Dr. André Marcio Murad*

As abordagens mais comuns para a detecção da metilação são baseadas na conversão de bases de citosina não metilada em uracila após o tratamento com bissulfito de sódio, que é então convertido em timidina durante a PCR. Por esta abordagem, os alelos metilados tratados com bissulfito têm diferentes sequências de DNA em comparação com os correspondentes alelos não metilados.

As diferenças entre as sequências de DNA metiladas e não metiladas podem ser avaliadas por vários métodos, incluindo análise de enzimas de restrição sensíveis à metilação, PCR específica para metilação, PCR semiquantitativo, sequenciamento Sanger, pirosequenciamento e sequenciamento de próxima geração.O status de metilação de genes oncogênicos também pode ser avaliado por meio de análise de amplificação por sonda dependente da multiplexação (MS-MLPA) sensível à metilação. MS-MLPA é uma variante da PCR multiplexada na qual sondas oligonucleotídicas hibridizam amostras de DNA direcionadas são diretamente amplificadas usando um par de primers universais.

Este método não se baseia na conversão de bissulfito de bases de citosina não metiladas em uracilo. Em vez disso, as sequências alvo detectadas pelas sondas MS-MLPA contêm um local de restrição reconhecido por endonucleases sensíveis à metilação.

Um produto de amplificação da sonda será obtido apenas se o local CpG for metilado, porque as sondas digeridas não podem ser amplificadas durante a PCR.

O nível de metilação é determinado pela resolução de produtos de PCR por eletroforese capilar e pelo cálculo da razão normalizada de cada área do pico da sonda alvo em amostras digeridas e não digeridas.

A razão corresponde à porcentagem de metilação presente na amostra. Exemplos de aplicações da análise de metilação em oncologia incluem uma análise da hipermetilação do promotor MLH1 em carcinomas colorretais esporádicos com instabilidade dos microssatélites, uma análise do estado de metilação do promotor MGMT em pacientes com glioblastoma multiformes tratados com quimioterapia alquilante e metilação do promotor SEPT9 no DNA derivado de plasma sanguíneo em pacientes com câncer colorretal.

Perspectivas futuras: uso da análise de metilação em DNA tumoral plasmático para a detecção precoce de tumores

Um novo ensaio de sangue demonstrou eficácia na detecção de vários tipos de câncer em diferentes estágios da doença, de acordo com os resultados de dois estudos apresentados no ASCO Breakthrough em Bangkok de 2019. O estudo do Atlas do Genoma Circulante sem Células nos mostrou que esse teste de metilação direcionado para o DNA plasmático tem a capacidade de detectar a maioria dos cânceres, especialmente os de alto risco, com uma taxa de falso-positivo abaixo de 1%, além de prever com precisão tecido de origem para cânceres detectados.

Oxnard e colegas avaliaram o uso do sequenciamento de bissulfito direcionado do DNA livre de células plasmáticas para detecção simultânea de vários tipos de câncer e localização de tecidos de origem. O subestudo pré-planejado do estudo prospectivo, multicêntrico, observacional e de controle de casos do Genoma sem Célula Circulante (CCGA) – financiado pelo fabricante do teste sanguíneo Grail Inc. – incluiu 927 participantes, 654 dos quais com câncer (> 20 tipos de tumor, todos os estágios) e 273 dos quais estavam livres de câncer.

O estudo também incluiu 337 amostras não cancerígenas da coorte prospectiva multicêntrica STRIVE de mulheres submetidas a mamografia de rastreamento.

Bibliografia básica

1. Nygren AO, Ameziane N, Duarte HM, et al. Methylation-specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Res 2005;33(14):e128.

2. Hömig-Hölzel C, Savola S. Multiplex ligation-dependent probe ampli- fication (MLPA) in tumor diagnostics and prognostics. Diagn Mol Pathol 2012;21(4):189–206.

3. Warren JD, Xiong W, Bunker AM, et al. Septin 9 methylated DNA is a sensi- tive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med 2011;9:133.

4. https://www.healio.com/hematology-oncology/gastrointestinal-cancer/news/online/%7B8eb6b050-2178-49b8-9d6d-3d25b5a077b0%7D/novel-blood-tests-could-improve-cancer-detection?utm_source=selligent&utm_medium=email&utm_campaign=hematology%20oncology%20news&m_bt=3549794779979

* Professor Adjunto Coordenador da Disciplina de Oncologia da Faculdade de Medicina da UFMG e Diretor Clínico da Personal – Oncologia de Precisão e Personalizada e Diretor Científico do Laboratório Personal de Genética Molecular de Belo Horizonte, MG. Pós-Doutor em Genética pela UFMG e Diretor Científico do GBOP – Grupo Brasileiro de Oncologia de Precisão. Consultor da Twist Bioscience e Molecular Biotecnologi

Contatos

Molecular Biotecnologia
(31) 3568-5366
vendas@molecularbrasil.com.br
Twist Bioscience

Fonte: Labnetwork